Публикации автора

Условно-патогенная бактерия Erwinia rhapontici вызывает розовый бактериоз зерна пшеницы и ржи, существенно снижая качество зерновой продукции, что ограничивает экспорт зерна из Российской Федерации. Выделение чистой культуры бактерии необходимо для эффективной диагностики патогена с целью предотвращения его распространения. Присутствие E. rhapontici в зараженном растении в составе бактериального комплекса требует использования селективных факторов, таких как антибиотики. Изолируемый объект должен быть устойчивым к антибиотикам, используемым в питательной среде. В настоящем исследовании проведено определение устойчивости штаммов VNIIKR-B-0065 из Sorbus aucuparia и VNIIKR-B-0102 из Triticum durum к различным антибиотикам с применением диско-диффузионного метода и метода жидких сред. При использовании дисков с антибиотиками, наименьший уровень ингибирования роста целевой бактерии отмечен в вариантах с тилозином и ампициллином, что делает их перспективными для добавления в состав селективной питательной среды. Энрофлоксацин, цефтазидим, амикацин, ципрофлоксацин, меропенем, цефоперазон и тетрациклин статистически достоверно ингибировали рост E. rhapontici. Меропенем и энрофлоксацин подавляли рост патогена сильнее всего. В жидкой среде в присутствии 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого как стандартного индикатора окислительно-восстановительной реакции, были определены перспективные для использования в составе селективной питательной среды антибиотики и установлены их оптимальные концентрации, не влияющие на рост целевой бактерии. Ими являются ампициллин 0.1 мг/л, бацитрацин 100 мг/л, ванкомицин 0.1 мг/л, касугамицин 25 мг/л, новобиоцин 2.5 мг/л, пенициллин G 3 мг/л, тетрациклин 50 мг/л и тилозин 50 мг/л. Отмечено количественное различие в устойчивости к антибиотикам между двумя штаммами E. rhapontici, что может быть связано с их специфическими генетическими свойствами. Полученные результаты заложили основу для исследования большого числа изолятов E. rhapontici, для разработки окончательного состава селективной среды.

Erwinia rhapontici (Millard 1924) Burkholder 1948 – это фитопатогенная бактерия, вызывающая розовый бактериоз зерна у зерновых и зернобобовых культур, а также различные виды гнилей и другие симптомы у широкого перечня ценных сельскохозяйственных растений, и для полного понимания патогенного потенциала этой бактерии необходимо детально изучить максимально возможное число штаммов. Целью данной работы является создание комплексной характеристики бактериального штамма VNIIKRB- 0035 E. rhapontici, выделенного из ячменя обыкновенного озимого (Hordeum vulgare L.), происхождение – Республика Крым. В работе представлены его морфологические свойства, которые были изучены с помощью микроскопии клеток, а также фотографии колоний бактериальных культур на питательной среде R2A. Клетки данного штамма палочковидной формы, их размер 0,8–1,5 мкм в длину, 0,2–0,4 мкм в ширину. Бактериальные колонии штамма VNIIKR-B-0035 на среде R2A – беловатого цвета, слизистые, однородные, имеют круглую выпуклую форму, гладкую и блестящую поверхность, непрозрачны, а выработка водорастворимых пигментов отсутствует. Биохимические особенности были и з у ч е н ы н а б о р о м д л я и д е н т и ф и к а ц и и Enterobacteriaceae и физиологических сходных бактерий API 20E (Biomerieux, Франция). Бактерии этого штамма способны сбраживать многие виды сахаров, восстанавливают нитриты, не продуцируют аргининдигидролазу, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу, уреазу, индол, ацетоин, желатиназу и H S, а также не 2 способны утилизировать цитраты. Молекулярногенетическая характеристика проведена с использованием четырех ПЦР-тестов на различные гены, специфичных для данной фитопатогенной бактерии. Штамм VNIIKR-B-0035 идентифицирован с использованием ПЦР-тестов с праймерами TSU01/TSU02, ERH-1A/ERH-1B и isoRF/isoRR, а также путем секвенирования участка гена rpoD. Это первая молекулярно-генетическая идентификация E. rhapontici в России. Эта работа подтвердила, что ячмень обыкновенный (Hordeum vulgare L.) может служить источником изоляции E. rhapontici.

Возбудитель желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici (Carlson & Vidaver) Zgurskaya et al. входит в Единый перечень карантинных объектов Евразийского экономического союза. Быстрая идентификация возбудителя является важным элементом в сфере карантина растений. Метод ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) наиболее оптимален при проведении лабораторной диагностики. В настоящий момент существует только два теста ПЦР-РВ для идентификации Rathayibacter tritici, разработанные Postnikova et al., 2017. Тесты предназначены для идентификации Rathayibacter tritici в чистых бактериальных культурах. Сведения о значениях основных параметров применимости теста ПЦР-РВ – аналитической специфичности, включая эксклюзивность и инклюзивность, и аналитической чувствительности, – а также об испытаниях теста для обнаружения патогена в растительных образцах в оригинальной статье отсутствуют. Целью настоящей работы являлась оценка применимости ранее известных тестов ПЦР-РВ для идентификации R. tritici. Материалами исследований являлись штаммы R. tritici, а также 26 штаммов бактерий рода Rathayibacter, включая все существующие виды внутри указанного рода. В результате оценки применимости тестов ПЦР-РВ для идентификации возбудителя желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici было установлено, что значение инклюзивности – способности теста идентифицировать все многообразие штаммов бактерии внутри вида – для исследуемых тестов составляет 83,3%. Использование указанных тестов позволило идентифицировать 5 из 6 штаммов целевого объекта – Rathayibacter tritici. Значение эксклюзивности – способности теста отличать целевые штаммы от нецелевых – составило 100% для обоих тестов. Тесты ПЦР-РВ, разработанные Postnikova et al., 2017, несмотря на их высокую эксклюзивность (100%), неприменимы для фитосанитарной диагностики, поскольку в случае их применения достаточно высоким является риск ложноотрицательных результатов и, как следствие, проникновения карантинного фитопатогена на новые территории.

Возбудитель бурой бактериальной гнили влагалища листа злаковых культур Pseudomonas fuscovaginae представляет угрозу производству риса, пшеницы, кукурузы, сорго и других злаковых культур. В целях предотвращения распространения опасной бактерии с семенным материалом и своевременного обнаружения и идентификации возбудителя в посевах ценных сельскохозяйственных злаковых культур, необходимо применение современных методов диагностики. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР) уникальных для фитопатогена участков генома с последующей детекцией продуктов этой реакции. Нами проведена апробация описанных в литературе для идентификации P. fuscovaginae тестов ПЦР Pfs207-F/Pfs207-R, PfF3/PfR3 и F3/B3 с последующей детекцией продуктов путем гель-электрофореза. Тест F3/B3 проведен также в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I. Указанные тесты позволяют обнаруживать ДНК P. fuscovaginae с аналитической чувствительностью 105 КОЕ/мл, 102 КОЕ/мл и 103 КОЕ/мл соответственно. На основе тестов Pfs207-F/Pfs207-R и PfF3/PfR3 проведена разработка новых тестов ПЦР-РВ: Pfs207-Fnew2/Pfs207-R/ Pfs207-P3 и PfF3NEW/PfR3/PfP3, аналитическая чувствительность которых составила 102 КОЕ/мл и 104 КОЕ/мл соответственно. Для всех тестов, исследованных в работе, отсутствовали положительные реакции с ДНК некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas, не принадлежащих виду P. fuscovaginae. Тесты Pfs207-F/Pfs207-R, PfF3/PfR3, F3/B3 (в том числе с использованием SYBR Green I) и новый тест ПЦР-РВ PfF3NEW/PfR3/PfP3 могут быть использованы для идентификации P. fuscovaginae. Разработанный в исследовании тест ПЦР-РВ Pfs207-Fnew2/Pfs207-R/Pfs207-P3 может быть использован для идентификации P. fuscovaginae в растительных образцах. В результате исследования, собрана информация о существующих тестах ПЦР для идентификации P. fuscovaginae и их применении с использованием реактивов российского производства, а также разработаны новые тесты ПЦР-РВ. Предпосевное ПЦР-тестирование семян и ранняя диагностика бактериоза в посевах злаковых культур позволит своевременно принять меры по ограничению распространения P. fuscovaginae.