Публикации автора

ВВЕДЕНИЕ. Разработка биофармацевтического препарата для ферментной заместительной терапии на основе рекомбинантной кислой α-1,4-глюкозидазы (α-глюкозидаза) является актуальной задачей, решение которой может позволить обеспечить пациентов с болезнью Помпе необходимым количеством препарата в Российской Федерации. В работе показан эффективный способ получения стабильного промышленного клона-продуцента на основе клеток линии СНО-К1, продуцирующего активную α-глюкозидазу.

ЦЕЛЬ. Получение моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантной кислой α-глюкозидазы и оценка стабильности ростовых показателей и продуктивности в ходе культивирования в течение 60 генераций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Суспензионную клеточную линию СНО-К1 (ECACC) культивировали в среде BalanCD Growth A. Трансфекцию клеток проводили электропорацией на системе MaxCyte (по протоколу СНО). Селекцию продуцентов проводили с использованием пуромицина (5 мкг/мл). Клонирование осуществляли с помощью системы дозирования клеток на основе микрофлюидной технологии (C. SIGHT). Моноклональность клеточных линий подтверждали с применением автоматизированной системы визуализации клеток (Cell Metric CLD). Концентрацию α-глюкозидазы в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Активность фермента измеряли колориметрически с субстратом 4-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид (pNP-α-D-Glc).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен скрининг 1000 продуцентов, в результате которого отобраны 22 клеточные линии с продуктивностью 0,14–0,65 г/л. Лидерный продуцент α-глюкозидазы GAA-14 клонировали с последующим подтверждением моноклональности. Получена панель из 20 моноклональных линий. Удельная активность фермента и содержание остатков маннозо-6-фосфата (М6Р) (4,3±0,9 ЕД/мг; 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка соответственно) не отличались от референтного препарата. При изучении стабильности лидерного к лона в течение 60 генераций показано сохранение ростовых характеристик: жизнеспособность 98,5±1,5%, время удвоения популяции 20,0±1,3 ч, продуктивность 450±20 мг/л при периодическом культивировании в течение 7 сут.

ВЫВОДЫ. Получена стабильная моноклональная клеточная линия-продуцента α-глюкозидазы на основе СНО-К1, обеспечивающая продукцию активного фермента 0,45 г/л на 7 сут. Полученный клон-продуцент пригоден для масштабирования и наработки субстанции для доклинических исследований.

ВВЕДЕНИЕ. Несмотря на широкое использование в генотерапевтических препаратах на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) искусственных промоторов, основанных на промоторе β-актина курицы (обозначаемых как CAG, CBA или CB), данные об активности таких промоторов в разных тканях и возрастной динамике остаются ограниченными. В настоящей работе проведена количественная оценка активности CAG-промотора в различных органах мышей в постнатальном периоде для определения его применимости при разработке rAAV-опосредованной терапии.

ЦЕЛЬ. Оценка относительной активности CAG-промотора и ее динамики в органах мышей в возрасте 3–12 недель.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 2-дневным мышам линии ICR (CD-1) однократно вводили rAAV9 с кассетой для экспрессии SMN под контролем CAG-промотора. На 3, 6 и 12-й нед. после инъекции из образцов органов (головной мозг, спинной мозг, печень, легкие, сердце, четырехглавая мышца бедра) выделяли тотальную ДНК и РНК. Содержание вирусных геномов rAAV и мРНК SMN в препаратах нуклеиновых кислот определяли методом количественной ПЦР. Относительную активность промотора рассчитывали как отношение концентрации мРНК SMN к концентрации вирусных геномов (rAAV), нормализованное на соотношение РНК: ДНК в органе. Для анализа данных вычисляли среднее геометрическое и использовали регрессионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Активность CAG-промотора значительно варьировала в разных органах. На 3 нед. после инъекции наибольшие значения активности отмечены в четырехглавой мышце бедра, в 4,7–9,7 раза превышающие таковые в других органах. Также обнаружено, что в головном мозге и легких с 3 по 12 нед. после инъекции активность промотора снижалась в 4,7 раза (p=0,0094) и в 5,2 раза (p=0,0039) соответственно, в то время как в других тканях существенных изменений активности не наблюдалось.

ВЫВОДЫ. C AG-промотор малопригоден д ля экспрессии т рансгена в к летках легких и головного мозга вследствие транскрипционного сайленсинга, а также не является оптимальным для экспрессии в клетках печени из-за относительно низкой активности. Эти данные следует учитывать при разработке генотерапевтических препаратов.