Публикации автора

ВВЕДЕНИЕ. Традиционные методы обнаружения иммуноглобулинов G (IgG) в сыворотке крови основаны на применении антител, химически конъюгированных с ферментными или флуоресцентными метками. Эффективность таких методов ограничивается стерическими помехами, возникающими в процессе химической конъюгации. В качестве альтернативы для иммунофлуоресцентного анализа IgG предложены бифункциональные гибридные белки Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 на основе Z-домена белка A Staphylococcus aureus и ярких флуоресцентных белков mHoneydew и CyOFP1, которые сочетают способность связываться с IgG и интенсивную флуоресценцию, а их получение исключает этап химической конъюгации.

ЦЕЛЬ. Получение гибридных белков на основе Z-домена белка A для создания универсальных флуоресцентных реагентов для обнаружения IgG в сыворотке крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Генетические конструкции pCCO-Z-mHoneydew и pCCO-Z-CyOFP1 получали методами молекулярного клонирования в вектор pCCO. Экспрессию белков Z-mHoneydew и Z-CyOFP1 (~35 кДа) проводили в Escherichia coli штамм M15. Белки очищали аффинной хроматографией на Ni²+-NTA агарозе. Свойства белков изучали с использованием спектрофлуориметрии, иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунофлуоресцентного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Генетические конструкции pCCO-Z-mHoneydew и pCCO-Z-CyOFP1 под контролем промотора T5 кодируют гибридные белки со следующей структурой: Z-домен белка A — гибкий линкер (Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly) — флуоресцентный белок mHoneydew или CyOFP1 — гексагистидиновая метка. При экспрессии выход растворимых белков составил ~37 мг/л (Z-mHoneydew) и ~6 мг/л (Z-CyOFP1) с чистотой ≥90%. Максимумы возбуждения и эмиссии Z‑mHoneydew зарегистрированы при длинах волн 480 и 536 нм соответственно со сдвигом эмиссии в синюю область на 26 нм относительно нативного mHoneydew (562 нм). Максимум возбуждения Z‑CyOFP1 зарегистрирован при 515 нм со сдвигом в красную область на 18 нм относительно нативного CyOFP1 (497 нм) при сохранении максимума эмиссии. Методом ИФА показано дозозависимое связывание IgG c гибридными белками. Для Z-mHoneydew линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций от 30 до 235 нг/мкл (R²=0,96), а для Z-CyOFP1 — от 15 до 250 нг/мкл (R²=0,97), что подтверждает способность гибридных белков связываться с IgG. Данные иммунофлуоресцентного анализа указали на возможность обнаружения IgG, специфических к конъюгату бензо[а]пирена с бычьим сывороточным альбумином, в сыворотке крови кролика с использованием гибридных белков. Линейная зависимость для Z-mHoneydew наблюдалась в диапазоне разведений сыворотки 1:10–1:160 (R²=0,92), а для Z-CyOFP1 — 1:10–1:80 (R²=0,98), что свидетельствует о пригодности данных белков для обнаружения специфических антител в сыворотке крови.

ВЫВОДЫ. Гибридные б елки Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 с охраняют ф луоресцентные с войства и способность связываться с IgG, в том числе с IgG сыворотки крови, что перспективно с точки зрения разработки прототипов универсальных иммунофлуоресцентных тест-систем.