Публикации автора

ВВЕДЕНИЕ. Разработка биофармацевтического препарата для ферментной заместительной терапии на основе рекомбинантной кислой α-1,4-глюкозидазы (α-глюкозидаза) является актуальной задачей, решение которой может позволить обеспечить пациентов с болезнью Помпе необходимым количеством препарата в Российской Федерации. В работе показан эффективный способ получения стабильного промышленного клона-продуцента на основе клеток линии СНО-К1, продуцирующего активную α-глюкозидазу.

ЦЕЛЬ. Получение моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантной кислой α-глюкозидазы и оценка стабильности ростовых показателей и продуктивности в ходе культивирования в течение 60 генераций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Суспензионную клеточную линию СНО-К1 (ECACC) культивировали в среде BalanCD Growth A. Трансфекцию клеток проводили электропорацией на системе MaxCyte (по протоколу СНО). Селекцию продуцентов проводили с использованием пуромицина (5 мкг/мл). Клонирование осуществляли с помощью системы дозирования клеток на основе микрофлюидной технологии (C. SIGHT). Моноклональность клеточных линий подтверждали с применением автоматизированной системы визуализации клеток (Cell Metric CLD). Концентрацию α-глюкозидазы в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Активность фермента измеряли колориметрически с субстратом 4-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид (pNP-α-D-Glc).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен скрининг 1000 продуцентов, в результате которого отобраны 22 клеточные линии с продуктивностью 0,14–0,65 г/л. Лидерный продуцент α-глюкозидазы GAA-14 клонировали с последующим подтверждением моноклональности. Получена панель из 20 моноклональных линий. Удельная активность фермента и содержание остатков маннозо-6-фосфата (М6Р) (4,3±0,9 ЕД/мг; 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка соответственно) не отличались от референтного препарата. При изучении стабильности лидерного к лона в течение 60 генераций показано сохранение ростовых характеристик: жизнеспособность 98,5±1,5%, время удвоения популяции 20,0±1,3 ч, продуктивность 450±20 мг/л при периодическом культивировании в течение 7 сут.

ВЫВОДЫ. Получена стабильная моноклональная клеточная линия-продуцента α-глюкозидазы на основе СНО-К1, обеспечивающая продукцию активного фермента 0,45 г/л на 7 сут. Полученный клон-продуцент пригоден для масштабирования и наработки субстанции для доклинических исследований.

ВВЕДЕНИЕ. В мире насчитывается от 6000 до 8000 описанных редких (орфанных) заболеваний (ОЗ), из которых около 80% имеют генетическую природу и часто являются жизнеугрожающими. Исторически разработка лекарственных средств (ЛС) для лечения ОЗ была затруднена из-за отсутствия экономических стимулов. За последние 10 лет в России наблюдается активный рост числа одобренных новых ЛС для ОЗ.

ЦЕЛЬ. Проследить историю подходов к лечению наиболее распространенных моногенных орфанных заболеваний и провести анализ проблемных аспектов разработки орфанных препаратов и внедрения их в медицинскую практику.

ОБСУЖДЕНИЕ. Исторические примеры ОЗ иллюстрируют как медленный прогресс терапии от симптоматической до патогенетической (муковисцидоз), так и взрывной рост патогенетических ЛС разных типов действующих субстанций и механизмов действия там, где до этого не было никакой эффективной терапии (спинальная мышечная атрофия). Показан путь от симптоматического лечения и первых заместительных подходов до современных патогенетических и этиотропных стратегий лечения ОЗ, включая рекомбинантные белки, малые молекулы (потенциаторы и корректоры), олигонуклеотидные препараты, ферментозаместительную терапию и генную терапию на основе аденоассоциированных вирусных векторов. Особое внимание уделено подходам по преодолению таких барьеров, как вирусная безопасность, доставка препаратов через гематоэнцефалический барьер («троянские кони»), и проблемам коммерциализации генной терапии. Рассмотрены современные регуляторные механизмы и меры поддержки разработки орфанных ЛС в России, странах ЕАЭС и мире. Предлагаются пути гармонизации регуляторных требований для повышения доступности терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Опыт последних десятилетий свидетельствует о трансформации подхода к ОЗ, которые перестали быть «безнадежными» и перешли в область наиболее интенсивного развития биомедицинских технологий. Дальнейший прогресс будет связан не только с созданием новых методов генной и клеточной терапии, но и с выстраиванием эффективных регуляторных, экономических и социальных механизмов, которые обеспечат равный доступ пациентов к терапии.